一、測定標準

      參考食品國家標準：GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數測定》。

二、操作過(guò)程

 1、前期準備：

      根據國家標準，提前準備好要用的平板計數瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等，相應的材料進(jìn)行滅菌處理（干熱滅菌或高壓滅菌）。

2、接收樣品：

      收到樣品后，確認樣品包裝是否完好，登記樣品信息，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在取樣時(shí)取出。

3、樣品處理：

      按照作業(yè)指導書(shū)操作，仔細閱讀實(shí)驗要求。一般實(shí)驗室收到的是干粉樣品、固體樣品、或者液體樣品等。假如收到干粉樣品，那么首先需要將其配置成水溶液（即水化）。根據實(shí)驗要求及經(jīng)驗，進(jìn)行預判，預估稀釋液倍數，溶解即可。

4、實(shí)驗前準備：

       4.1實(shí)驗操作最好在超凈臺或者生物安全柜里操作，需要把超凈臺或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實(shí)驗環(huán)境無(wú)菌。

       4.2提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺上紫外殺菌。

5、實(shí)驗操作：

      5.1稀釋

      將樣品從冰箱中取出達到室溫后開(kāi)始取樣，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無(wú)菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進(jìn)行洗滌并全部轉入無(wú)菌瓶或袋中。

      洗滌轉移時(shí)注意樣品瓶蓋的清洗和無(wú)菌操作，將全部的水化液進(jìn)行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進(jìn)行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1ml無(wú)菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類(lèi)推。再將幾個(gè)稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無(wú)菌平皿中。

      5.2傾注平板

      將提前在水浴鍋里涼至46℃的平板計數營(yíng)養瓊脂培養基注入平皿約15ml，并轉動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。傾注過(guò)程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開(kāi)30°左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺面上。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h。

     5.3觀(guān)察計數

      24h觀(guān)察檢測結果有無(wú)異?，F象，是否有蔓延菌落出現。48h再按照GB 4789.2的要求進(jìn)行菌落計數。在對結果進(jìn)行分析后，選取檢測結果的平均值為最終數據。

三、注意事項

1、當無(wú)法預判樣品菌落總數含量時(shí)，需要梯度稀釋?zhuān)瞬襟E尤其關(guān)鍵，必須盡可能地減少誤差。

2、傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過(guò)高會(huì )影響細菌生長(cháng)，過(guò)低瓊脂易凝固，不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴條件，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

3、傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過(guò)厚會(huì )影響觀(guān)察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀(guān)察。

4、傾注過(guò)程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來(lái)。

5、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時(shí)要盡可能放在中央部位，然后應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不易過(guò)長(cháng)，以防止細菌有所死亡或繁殖。

6、瓊脂培養基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現平皿不凝固現象；拿出傾注時(shí)要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

7、冷卻的過(guò)程不要著(zhù)急，冷卻充分后再倒置放進(jìn)培養箱培養，放置的時(shí)候要盡量避免放到風(fēng)機口處，每摞不要超過(guò)6個(gè)平皿。

8、檢測結束后所有的稀釋液樣品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以備實(shí)驗出錯時(shí)再用。

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